螢火蟲熒光素酶報告基因（報告基因）

大家好，我是小夏，我來為大家解答以上問題。螢火蟲熒光素酶報告基因，報告基因很多人還不知道，現在讓我們一起來看看吧！

1、（1）最常用的報告基因大多是編碼抗生素抗性蛋白的基因，通過檢查產物是否具有抗生素的抗性來確定基因的表達情況。

2、（2）氯霉素乙酰基轉移酶（CAT）：該報告基因來源于大腸桿菌轉位子9，是第1個用于檢測細胞內轉錄活性的報告基因。氯霉素乙酰基轉移酶可催化乙酰CoA的乙酰基轉移到氯霉素3羥基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳細胞無內源性表達，性質穩定，半衰期較短，適于瞬時表達研究。可用同位素、熒光素和酶聯免疫吸附測定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA）檢測其活性，也可進行蛋白質印跡（Westernblotting）和免疫組織化學分析。CAT與其他報告基因相比，線性范圍較窄，靈敏性較低。

3、（3）β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。最大優勢是易于用免疫組織化學法觀測其原位表達，是最常用的監測轉染率的報道基因之一。以鄰—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷（ONPG）為底物可用標準的比色法檢測酶活性，其檢測動力學范圍為6個數量級。氯酚紅—β—D—半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一個可用比色法檢測酶活性的底物，其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷（FDG）為底物則可用熒光法檢測其活性。此法可檢測單個細胞的酶活性，并可用于流式細胞學（FACS）分析。如以二氧雜環丁烷為底物，可用化學發光法檢測酶活性，其檢測動力學范圍最大，靈敏度最高，與用生物發光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。

4、（4）熒光素酶：熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發光的一類酶，哺乳細胞無內源性熒光素酶。最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶。細菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細胞的應用中受到限制。螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測線性范圍寬達7～8個數量級，是最常用于哺乳細胞的報道基因，用熒光比色計即可檢測酶活性，因而適用于高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應用，無需裂解細胞即可檢測酶活性。Renilla熒光素酶催化腸腔素（coelenterazine）氧化，產物可透過生物膜，可能是最適用于活細胞的報告分子。將熒光素酶報告基因載體轉染到細胞中，可用熒光素酶檢測系統靈敏方便地測定熒光素酶基因的表達。自1986年起，螢火蟲熒光素酶基因被用作測定基因表達的報告基因，獲得了廣泛的應用。Promega公司的pGL3及pGL2系列載體，含SV40啟動子及增強子的不同組合，有助于分析DNA片段的轉錄活性。

5、熒光素酶報告基因有許多優點：①非放射性；②比CAT及其他報告基因速度快；③比CAT靈敏100倍；④熒光素酶在哺乳細胞中的半衰期為3小時，在植物中的半衰期為3．5小時。由于半衰期短，故啟動子的改變會即時導致熒光素酶活性的改變，而熒光素酶不會積累。相反，CAT在哺乳細胞中的半衰期為50小時。熒光素酶濃度在10—16mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）范圍內，熒光信號強度與酶濃度成正比。在理想條件下，可檢測到l0-20mol/L的熒光素酶。Promega公司的熒光素酶檢測系統比一般的方法靈敏及簡單，產生的光穩定。

6、（5）分泌型堿性磷酸酶（SEAP）：SEAP是人胎盤堿性磷酸酶的突變體，無內源性表達。SEAP缺乏胎盤堿性磷酸酶羧基末端的24個氨基酸。其優點是無需裂解細胞，只用培養介質即可檢測酶活性，便于進行時效反應試驗。以間硝基苯磷酸鹽（PNPP）為底物時可用標準的比色法測定酶活性，操作簡單，反應時間短，價格廉價，但靈敏度低。以黃素腺嘌呤二核苷酸磷酸為底物進行比色測定，其靈敏度增高。SEAP可催化D—熒光素—O—磷酸鹽水解生成D—熒光素，后者又可作為熒光素酶的底物，此即兩步生物發光法檢測酶活性的原理。此方法靈敏度高，接近于熒光素酶報告基因的檢測。還可用一步化學發光法檢測酶活性。

7、（6）熒光蛋白家族：熒光蛋白家族是從水螅綱和珊瑚類動物中發現的相對分子質量為20 000～30 000的同源蛋白。綠色熒光蛋白(GFP）是應用最多的發光蛋白。GFP存在于發光水母（AequoreaVictoria）中。用395 Bin的紫外線和475 nm的藍光激發，GFP可在508nm處自行發射綠色熒光，無需輔助因子和底物。GFP最大的優勢是無需損傷細胞即可研究細胞內事件。1991年克隆了GFP基因，已獲得幾個突變體，如“紅色遷移”突變體（red—shiftmutant），其熒光更強。其他突變體還有藍色熒光蛋白（BFP）、增強型GFP(EGFP）和去穩定EGFP(destabilizedEGFP）等。紅色熒光蛋白（RFP）是從珊瑚（Discosoma sp．）中分離的發光蛋白（drFP583或DsRed），可發射明亮的紅色熒光。這些常用的報告基因也可被聯合應用，同時檢測2個甚至3個基因的表達。報告基因的選擇依賴于其靈敏性、可靠性及監測的動力學范圍。穩定性好的報告基因適于基因轉錄動力學研究和高通量篩選，尤其適用于基因轉移的定性研究。

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