納米技術能夠以近原子分辨率可視化RNA結構

我們生活在一個由RNA制造和運行的世界，RNA是基因分子DNA的同等重要的兄弟姐妹。事實上，進化生物學家假設RNA甚至在DNA及其編碼的蛋白質出現之前就存在并自我復制。快進到現代人類：科學表明，不到3%的人類基因組被轉錄成信使RNA(mRNA)分子，而信使RNA(mRNA)分子又被翻譯成蛋白質。相比之下，其中82%被轉錄成具有其他功能的RNA分子，其中許多仍然是神秘的。

要了解單個RNA分子的作用，需要在其組成原子和分子鍵的水平上破譯其3D結構。研究人員經常研究DNA和蛋白質分子，方法是將它們變成規則堆積的晶體，可以用X射線束(X射線晶體學)或無線電波(核磁共振)檢查。然而，這些技術不能以幾乎相同的效率應用于RNA分子，因為它們的分子組成和結構靈活性阻止它們容易形成晶體。

現在，由WyssCore教員PengYin博士領導的一項研究合作。在哈佛大學Wyss仿生工程研究所和MaufuLiao博士。在哈佛醫學院(HMS)，報告了一種全新的RNA分子結構研究方法。ROCK，顧名思義，使用RNA納米技術，可以將多個相同的RNA分子組裝成高度有序的結構，從而顯著降低單個RNA分子的靈活性并使其分子量成倍增加。研究小組將具有不同大小和功能的著名模型RNA用作基準，表明他們的方法能夠使用稱為冷凍電子顯微鏡的技術對所含RNA亞基進行結構分析(冷凍電鏡)。他們的進展發表在NatureMethods中。

“ROCK正在打破目前RNA結構研究的限制，并能夠以近原子分辨率解??鎖現有方法難以或不可能訪問的RNA分子的3D結構，”Yin說，他與Liao一起領導了這項研究.“我們預計這一進展將振興基礎研究和藥物開發的許多領域，包括新興的RNA治療領域。”Yin還是Wyss研究所分子機器人計劃的負責人，也是HMS系統生物學系的教授。

獲得對RNA的控制

威斯研究所的尹教授團隊開創了各種方法，使DNA和RNA分子能夠根據不同的原理和要求自組裝成大型結構，包括DNA磚和DNA折紙。他們假設這種策略也可用于將天然存在的RNA分子組裝成高度有序的環狀復合物，通過將它們特異性連接在一起，它們的彎曲和移動自由度受到高度限制。許多RNA以復雜但可預測的方式折疊，小片段彼此堿基配對。結果通常是穩定的“核心”和“莖環”向外圍凸出。

“在我們的方法中，我們安裝了‘接吻環’，將屬于相同RNA的兩個拷貝的不同外周莖環連接起來，從而形成一個整體穩定的環，包含多個感興趣的RNA拷貝，”Di說劉博士，兩位第一作者之一，尹氏課題組博士后。“我們推測這些高階環可以通過cryo-EM進行高分辨率分析，該技術已首次成功應用于RNA分子。”

描繪穩定的RNA

在低溫EM中，許多單個粒子在低溫下被快速冷凍以防止任何進一步的運動，然后通過電子顯微鏡和計算算法的幫助進行可視化，這些算法比較粒子的2D表面投影的各個方面并重建其3D結構.Peng和Liu與Liao和他的前研究生FrançoisThélot博士合作，后者是該研究的另一位共同第一作者。Liao和他的團隊為快速發展的低溫電磁場以及特定蛋白質形成的單個粒子的實驗和計算分析做出了重要貢獻。

“與傳統方法相比，Cryo-EM在查看包括蛋白質、DNA和RNA在內的生物分子的高分辨率細節方面具有很大優勢，但大多數RNA的小尺寸和移動趨勢阻礙了RNA結構的成功確定。我們組裝RNA多聚體的新方法通過增加RNA的大小并減少其運動，同時解決了這兩個問題，”同時也是HMS細胞生物學副教授的廖說。“我們的方法為通過冷凍電鏡快速測定許多RNA的結構打開了大門。”RNA納米技術和cryo-EM方法的整合使該團隊將他們的方法命名為“通過安裝接吻環實現RNA寡聚化的cryo-EM”(ROCK)。

為了為ROCK提供原理驗證，該團隊專注于來自單細胞生物四膜蟲的大內含子RNA和來自固氮細菌Azoarcus的小內含子RNA，以及所謂的FMN核糖開關.內含子RNA是散布在新轉錄的RNA序列中的非編碼RNA序列，必須“剪接”出來才能生成成熟的RNA。FMN核糖開關存在于與維生素B2衍生的黃素代謝物生物合成有關的細菌RNA中。在結合其中一種黃素單核苷酸(FMN)后，它會轉換其3D構象并抑制其母RNA的合成。

“將四膜蟲I組內含子組裝成環狀結構使樣品更加均勻，并能夠利用組裝結構的對稱性使用計算工具。雖然我們的數據集規模相對適中，但ROCK的先天優勢使我們能夠以前所未有的分辨率解決結構問題，”Thélot說。“RNA的核心分辨率為2.85Å[1Ångström是100億(US)米，是結構生物學家使用的首選度量標準]，揭示了核苷酸堿基和糖骨架的詳細特征。我不認為我們沒有ROCK就可以到達那里——或者至少在沒有更多資源的情況下不會。”

Cryo-EM還能夠捕獲處于不同狀態的分子，例如，如果它們改變其3D構象作為其功能的一部分。將ROCK應用于Azoarcus內含子RNA和FMN核糖開關，該團隊設法識別了Azoarcus內含子在其自剪接過程中轉變的不同構象，并揭示了FMN核糖開關配體結合位點的相對構象剛性.

“彭寅和他的合作者的這項研究優雅地展示了RNA納米技術如何作為促進其他學科發展的加速器。能夠可視化和理解許多天然存在的RNA分子的結構可能會對我們對許多生物學和病理學的理解產生巨大影響跨不同細胞類型、組織和生物體的過程，甚至可以實現新的藥物開發方法，”Wyss創始董事DonaldIngber醫學博士說。